解析病毒蛋白结构的三种方法

解析病毒蛋白结构的三种方法

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解析病毒蛋白结构的三种方法

谁把太君引进来的?

新冠病毒结构和成分简单,主要由包膜、遗传物质RNA以及各种蛋白组成。


RNA是遗传物质,M、E、N都是蛋白


上个月武汉病毒所石正丽团队发文认为,其中的S蛋白(spike蛋白、刺突蛋白)会选择性地结合人细胞膜上的ACE-2受体,从而欺骗细胞内吞病毒。


这就像病毒表面有一堆相同的钥匙,专开ACE-2这个锁,锁开了鬼子就进村。


反过来想,如果找到阻断剂和S蛋白特异性结合,病毒表面的钥匙就被套上了锁,锁没法开锁。另外,也可以想办法让钥匙插不进锁眼里,比如把钥匙“掰弯”等。这是从根源上治病的特效药。


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但是,如果不知道钥匙和锁长啥样,一把把锁去往钥匙上套,就要耗费大量精力。


因此,解析出病毒表面S蛋白的结构对指导药物设计和选择有重要意义。现在,能完成这个任务的方法主要有三个:冷冻电子显微镜X射线衍射以及核磁共振


冷冻电子显微镜(cryo-EM)

cryo-EM有两个关键词。一个是cryo,cryogenic,表示冷冻;另一个是EM,electric microscope,电子显微镜。


cryo-EM解析S蛋白可以概括为三步:提纯并冷冻电镜拍照算法重构三维模型。


  • 冷冻

手机版棋牌牛牛游戏将纯化后的蛋白溶液滴在铜网上,部分烘干后迅速将样品浸入液态乙烷(-190°C左右)。


天下武功唯快不破,几个毫秒内,正常的冰晶来不及形成,这些水分子完全变成玻璃态的冰,说白了就是液体时啥样,它们现在还啥样。这个冷冻的过程不会引起体积的明显变化干扰S蛋白的三维结构。


  • 电镜拍照

类似光学显微镜聚焦光束,电子枪的高能电子被聚焦在样品上,因为样品只有几十甚至十几nm厚(A4纸的千分之一),所以很多电子会直接穿过。


如果穿透路径上遇到阻碍(比如病毒表面的S蛋白),电子就有可能被散射,所以投影最终导致传感器接收到的电子数量因路径上的S蛋白而变,采集并分析信号就能实现成像。


  • 算法重构模型

S蛋白的影子被投射到直接电子相机(上图中的黑白像),这种相机可以把S蛋白在电子束下的活动全录下来,之后通过计算机的算法配合将二维蛋白图像重建为三维蛋白模型。


因为冷冻电镜的相关介绍已经很多,细节在此不展开。有兴趣的读者可以阅读这两篇文章:冷冻电镜-知识分子冷冻电镜-科普中国


虽然cryo-EM现在有着广泛应用,但是,这个技术真正成为结构生物学家眼里炙手可热的宝贝是近几年的事儿。上世纪cryo-EM的图像分辨率极度糟糕,蛋白结构解析出来就像块面团一样。


那时,蛋白库里80%以上的数据都归功于下面这种方法。


X射线衍射(XRD)

XRD有两个关键词:X射线和衍射。


X射线是波长很短,能量很大的电磁波。可见光波长在400-760nm左右,而X射线的往往小于1nm,相当于一个光子能量高了上千倍。


接下来说XRD中的“衍射”,因为能量高,入射x光会使蛋白中的内层电子发生受迫振动,振动以球面波的形式发出。这些球面波叠加后,某些方向上会出现相干相长,某些方向上相消。


获得的衍射图样携带样品信息,比如这两层原子面间的距离有多大,发出球面波的电子可能属于什么原子等等。我们可以根据衍射图样的信息反向推理出样品的结构特征。


类似地,分析蛋白时,首先需要把蛋白结晶,之后用XRD获得衍射图谱,经过计算机分析数据就能获得S蛋白的三维结构。


除了X光医院里另一项检查,核磁共振,却和解析蛋白3D结构的机理如出一辙。


核磁共振(NMR)

原子核是不断自旋的,因为带电,所以自身会产生内磁场,但是因为蛋白内的原子核太多,内部的小磁场方向杂乱无章,综合起来不对外显磁性。


右:朝上指是“屈服”的


一旦加上恒定外磁场,原子核能级会发生Zeeman裂分,有些核在外场下“屈服”(和外场方向相同),有些会“抵抗”,它们分别对应着外磁场下原子核的低能级和高能级,屈服的原子核多一些。可见核磁共振简介


进动的氢原子核(质子)


另外,由于扰动,原子核此时以Larmor进动的方式旋转,这种运动有个频率。


这时,在外加恒定磁场的基础上给一个射频脉冲,如果它的频率能匹配Larmor进动频率,两者发生共振,原子核吸收脉冲场的能量,发生能级跃迁。


结果是一部分本身屈服的原子核(低能级)会变成抵抗的原子核(高能级),但是一旦脉冲磁场被撤去,这种整体的高能状态不是稳定的,高能态的原子核会放出能量回到低能态。


重力或成最大赢家


因核磁共振而吸收和释放的能量大小,何时放出,持续多久等等信号会携带蛋白质中原子核的信息。举个简单的例子,原子核带正电,核外电子带负电,在外磁场作用下,分子中运动的电子会产生感生电流(可以这么理解)。


感生电流的磁场和原子核磁化的磁场正好相反,这是电子对核的屏蔽效应


H核受到真实的磁场应该用外磁场-感应磁场


相同的原子核在不同化学环境下等效的核外电子不一样,对核的屏蔽效应自然也不同,这就导致核感受到的磁场各异,在脉冲的作用下吸收和释放的能量各异。通过采集并分析类似信号就能重建三维的蛋白结构。


三种方法的对比

  • cryo-EM

RBD是受体结合域,专门结合ACE-2的


截至目前,本次新冠病毒的S蛋白膜外部分结构解析已经完成(上图),使用的正是cyro-EM技术。从上个月疫情爆发到现在,仅仅一个月。从获知S蛋白序列到合成出并进行测试,仅仅两星期。这是cryo-EM的最大优势,快!


这个技术的另一优势是对于膜蛋白等难结晶蛋白的解析能力,因为只需要提纯冷冻就行,很暴力的方法。


帮助膜蛋白结晶的方法


不过cryo-EM是依靠图像进行分析,也就是说,如果一种蛋白特别小,二维的图像不清晰,叠加分析后的三维图像也会失准。cryo-EM似乎还没突破解析100kDa以下大小的蛋白,200kDa以下都很吃力。


另外,cryo-EM测试环境和体内环境相去甚远,大活人身体里的水哪有玻璃态的。所以,其他生物领域的学者有时候会开玩笑结构生物学家做的是:结构死物学


  • XRD

和cryo-EM的快正相反的,XRD的技术难点就是结晶,因为需要晶体结构才能发生衍射。


首先,不是所有蛋白都乖乖结晶的。更可气的是,就算应该能结晶的蛋白也经常做不出合格的样品,比如总是难以获得大的单晶,所以衍射出来的图根本没法用。


在某种程度上说,结晶是个心诚则灵的过程。除了基本的酸碱度、沉淀剂和添加剂等,磁场,电场,重力场,光照缺一不可。


缘分到了之前,就是日复一日地机械劳作,因为大部分时间干的是不动脑的活,不太像个科学家,所以做这个方向的研究人员也会面临各样的嘲讽,比如生物民工这种。


虽然结晶有点类似玄学,但是,XRD分辨率高(cryo-EM大概为0.3nm,XRD为0.2nm)。另外,相比cryo-EM,因为它的原理不是拍照,所以只要能把蛋白单晶结好,它就能解析分子量很小的蛋白,测试跨度比较广。


上面两种方法的测试环境都很残酷,cryo-EM需要把样品冷冻到玻璃态,XRD干脆不测含水样品,这些和生物体内的真实环境相去甚远。相比他俩,NMR更接近结构“生”物学。


核磁共振仪器


  • NMR

NMR测蛋白时可以在水溶液中,pH值、温度和离子浓度等都随便调,甚至可以在测试途中加东西观察蛋白动态的变化,比如分析酶在催化反应中构象的改变。


不过,NMR的劣势之一是遇到大分子量的蛋白就乏力,正好和cryo-EM相反。好巧不巧,生物体中重要的蛋白,比如施一公搞的那些剪切体都是好多蛋白的复合物,分子量大得惊人,NMR没有用武之地。另外,这个方法分辨率往往也不高,自身原理受限,不展开了(作者看不懂了)。


结语

从时间上来讲,XRD最早,NMR次之,cryo-EM最新。新冠病毒S蛋白的结构就是cryo-EM这个后起之秀解出,颇有后浪把前浪拍到沙滩上的意思。


不过,正如cryo-EM是在近些年几个技术的加持下突然“弯道超车”,随着同步辐射光源自由电子激光的发展,XRD这一最老的方法也有了新的活力,甚至可以像NMR一样测量接近生理条件下蛋白的结构。


红色的那一束光就是X射线激光


也不是说NMR就完全不行了,cryo-EM和这个XRD plus版都贵的很,前者一台机器三千万起步,后者干脆需要好几个足球场的地皮专门建光源(下图的大型建筑就是为了上图中红色光束的那几下)。


左:上海同步辐射光源,右:加速器示意图


除了相互竞争,这三种方法有时候也会合作,联用表征更能说明问题。


最后,读者可能在读全文的时候都有一个疑问:这些被测试的蛋白是哪里来的,这个不能是心诚则灵的吧。从病毒表面提取的?非也非也,点个关注,下篇文章争取给你答案。


其实本文倒数第七张图中有答案,不知道会不会牛牛游戏有人猜对,留个言谈谈你的看法。


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